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恒奧德儀器紫外分光光度計儀器組成 測定方法

儀器組成

分光光度計已經(jīng)成為現代分子生物實(shí)驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長(cháng)濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。

光譜范圍

包括波長(cháng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區和波長(cháng)范圍為200～400 nm的紫外光區。不同的光源都有其*的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。

分光光度計圖片

分光光度計圖片(4張)

鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(cháng)的光譜光通過(guò)三棱鏡折射后,可得到由紅橙，黃綠，藍靛，紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計的光源。

氫燈（或氘燈）的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長(cháng)的光譜可作為紫外光光度計的光源。

蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

這種方法是在280nm波長(cháng)，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在些雜質(zhì)，般要消除320nm 的“背景"信息，設定此能“開(kāi)"。與測試核酸類(lèi)似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，佳的線(xiàn)性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現讀數“漂移"。這是個(gè)正常的現象。事實(shí)上，只要觀(guān)察A280的吸光值的變化范圍不過(guò)1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì )被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較。

比色法蛋白質(zhì)定量

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數目直接相關(guān)，從而反應蛋白質(zhì)濃度。

測定方法

比色方法

般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

Lowry 法：以早期的Biuret 反應為基礎，并有所改。蛋白質(zhì)與Cu2 反應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時(shí)間較長(cháng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應產(chǎn)生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(cháng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系較強，反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其大的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡(jiǎn)單，速度更快；只需要種反應試劑；化合物可以穩定1小時(shí)，方便結果；而且與系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。主要的缺點(diǎn)是不同的標準品會(huì )導致同樣品的結果差異較大，無(wú)可比性。